Manuscritos castellanos
A pesar de los prejuicios en curso contra los libros escritos en idioma vulgar, Felipe II dio cabida en su Biblioteca a libros escritos en romance, especialmente antiguos, por su importancia para el estudio de la lengua y para la historia. De hecho, entre los primeros envíos aparecen ya algunos códices castellanos como el "Calila y Dimna".
Como procedentes de la librería del rey son dignos de resaltar: dos valiosos códices en pergamino del "Libro de la Montería" de Alfonso XI, uno de ellos iluminado; una numerosa colección de "Crónicas del reino de Castilla", varias obras de Alfonso el Sabio : "Libro de Ajedrez, dados y tablas" y el "Saber de Astronomía".
En 1592 se enriquece la Biblioteca con los autógrafos de Santa Teresa de Jesús. El "Libro de las Fundaciones" y "Visita de Descalzas" fueron enviados desde Valladolid; en cambio, el "Libro de la Vida" y "Camino de perfección" fueron entregados por los agustinos de Salamanca que los poseían desde que fray Luis de León hizo la edición de estos originales en 1588.
Los manuscritos castellanos son unos 800 (751 en el ordenador), y , además de los indicados, son dignos de resaltar, por sus miniaturas: "Relación de las ceremonias y ritos de los indios de Mechuacán"; la "Historia Troyana". Por su valor lingüístico: la colección de "Biblias Castellanas". Por su valor documental: 24 códices de las "Cortes de Castilla" y dos de los "Ordenamientos de Alcalá"; los manuscritos de las "Partidas y Fuero Real de Castilla", "Relaciones geográficas de los pueblos de España", etc.