Composición del fondo bibliográfico manuscrito
Este fondo está clasificado por lenguas: Manuscritos latinos, griegos, hebreos, árabes, castellanos y otras lenguas
Manuscritos latinos
Los códices latinos superaron a los de las demás secciones, tanto por su calidad como por su cantidad. Según los inventarios antiguos, se calcula que la Laurentina, incluyendo los 600 añadidos en el siglo XVII procedentes de la biblioteca del Conde Duque de Olivares, llegó a poseer unos 4.000 manuscritos latinos. En la actualidad, el número de manuscitos que contienen obras latinas, contando los que se hallan entre los impresos, es de 1370.
Retornando al fondo de manuscritos latinos, podemos enumerar entre los más notables, por sus bellas miniaturas: "el "Apocalipsis de la Casa de Saboya", el "Comentario al Apocalipsis del Beato de Liébana", el "Códice Aureo". Por su gran antigüedad: el "De baptismo", de S. Agustín, escrito en letra uncial del siglo V-VI; el "Códice Ovetense" ("Itinerarios del Emperador Antonino), del siglo VII, en escritura uncial y palimpsesto. Por su caligrafía visigótica y valiosos textos: el "Códice Emilianense", el "Códice Vigilano" y el "Codex Regularum".
Manuscritos griegos
El fondo de códices griegos que Felipe II logró reunir en El Escorial, después de treinta años de adquisiciones, por compra o donación, llegó a ser uno de los mejores de Europa, sobrepasando su número a finales del siglo XVI los 1.150 volúmenes. En la actualidad suman 649 volúmenes.
Como códices notables, son dignos de resaltar por sus bellas miniaturas: "Himnos a la Virgen" (Akathistos), un "Nuevo Testamento" en vitela y fina ornamentación. Por la importancia de los textos: "Discursos de rétores de Constantinopla en el s. XII"; "Colección de fragmentos desconocidos de historiadores griegos"; "Ciropedia de Jenofonte"; "Ilíada" de Homero, etc.

Manuscritos hebreos
Aunque la colección de códices hebreos de El Escorial no fue numerosa en cantidad, es, sin embargo, importante por la calidad de algunos de sus manuscritos. Su número no llegó a superar los 110, debido a que escaseaban en España por entonces tales obras a causa de la persecución incesante a que fue sometida toda la literatura judía por el Tribunal de la Inquisición. Como decía Arias Montano, "de libros hebraicos, de que hubo grande riqueza en España, hay ahora grande pobreza, y los más de los que aparecen en Italia vienen de Levante y en aquella lengua ha habido mucha lección y de todo género de artes".
En la actualidad, el número de manuscritos hebreos asciende a 76. Existe, además, una valiosa colección de obras impresas en hebreo del siglo XVI, que se conserva en el estante 83, que comprende cerca de 150 volúmenes.
Como códices más notables se pueden indicar: la "Biblia de Arias Montano”, de fina vitela y bella ornamentación, que fue utilizada en el texto hebreo de la Políglota de Alcalá; el G-I-8, temas gramaticales, copiado por Alfonso de Zamora en Alcalá de Henares en 1519; hay otros dos códices aljamiados árabes con caracteres rabínicos.

Manuscritos árabes
A Felipe II cabe la gloria de reconocer el valor científico de la cultura árabe, al coleccionar toda clase de códices procedentes del mundo musulmán en El Escorial, como le aconsejaba Arias Montano con estos argumentos: "Cuanto se sabía y estudiaba en Europa de trescientos años atrás hasta setecientos manaba de libros arábigos... Para todo buen suceso es bien que en el tesoro de libros de su Majestad haya copia de los de esta lengua, aunque ahora no se entienda ni se use entre los estudiosos".
A pesar de que en el incendio de 1671 perecieron unos 2.500 códices árabes, en la actualidad se conservan en torno a 2.000 volúmenes. Como códices más notables se pueden indicar: El Corán de Muley Zaydan (Árabe 1340), Concilios Hispano-Visigóticos (Árabe 1623) o el Libro de las utilidades de los animales (Árabe 898).

Manuscritos castellanos
A pesar de los prejuicios en curso contra los libros escritos en idioma vulgar, Felipe II dio cabida en su Biblioteca a libros escritos en romance, especialmente antiguos, por su importancia para el estudio de la lengua y para la historia. De hecho, entre los primeros envíos aparecen ya algunos códices castellanos como el "Calila y Dimna".
Como procedentes de la librería del rey son dignos de resaltar: dos valiosos códices en pergamino del "Libro de la Montería" de Alfonso XI, uno de ellos iluminado; una numerosa colección de "Crónicas del reino de Castilla", varias obras de Alfonso el Sabio : "Libro de Ajedrez, dados y tablas" y el "Saber de Astronomía".
En 1592 se enriquece la Biblioteca con los autógrafos de Santa Teresa de Jesús. El "Libro de las Fundaciones" y "Visita de Descalzas" fueron enviados desde Valladolid; en cambio, el "Libro de la Vida" y "Camino de perfección" fueron entregados por los agustinos de Salamanca que los poseían desde que fray Luis de León hizo la edición de estos originales en 1588.
Los manuscritos castellanos son unos 800 (751 en el ordenador), y , además de los indicados, son dignos de resaltar, por sus miniaturas: "Relación de las ceremonias y ritos de los indios de Mechuacán"; la "Historia Troyana". Por su valor lingüístico: la colección de "Biblias Castellanas". Por su valor documental: 24 códices de las "Cortes de Castilla" y dos de los "Ordenamientos de Alcalá"; los manuscritos de las "Partidas y Fuero Real de Castilla", "Relaciones geográficas de los pueblos de España", etc.
Manuscritos en otras lenguas
Además de los fondos indicados, la Biblioteca Escurialense incorporó una serie de códices en lenguas distintas de las reseñadas. Se conservan, por ejemplo, 80 mss. italianos, unos 50 catalanes o valencianos, unos 30 franceses o provenzales, unos 20 persas, unos 15 portugueses o gallegos, unos 10 turcos, un par de armenios, otros tantos alemanes y un manuscrito mejicano en lengua nahuatl.
Algunos de estos manuscritos son muy notables, como los dos ejemplares de las Cantigas de Alfonso el Sabio, escritos en gallego.
